花生(Arachis hypogaeaL.)属严格的自花授粉作物，通过人工操作可进行杂交制种，但成功率不高，容易产生假杂种。长期以来，对花生杂种的真伪鉴别主要依靠田间表型观察。由于花生品种间遗传基础狭窄，形态表型差异较小且不易区分，通过形态表型鉴别杂种真伪难度较大，育种家常因田间鉴定不正确导致育种工作无功而返。许多遗传群体的创建，如回交群体、代换系群体和近等基因系群体，往往要求在苗期完成杂种真伪鉴定，而在苗期株系间、或回交后代间的形态表型差异则更小，用肉眼几乎是无法辨别其杂交后代之真伪。显然，发展一种高效的花生杂种真伪鉴别方法是十分必要的。

DNA分子标记，如RFLP、RADP和AFLP等，是杂交种真伪和品种纯度鉴定有效的手段之一，在水稻、棉花、油菜等作物上已有广泛应用(郭向阳等, 2011; 李景环和云锦凤, 2009; 刘平武等, 2005; 马秀芳等, 2006)。但对花生栽培种而言，由于其较低的DNA多态性导致分子标记在花生上的应用受到限制。近年来，许多研究表明SSR(simple sequence repeats)在花生栽培种中具有较高的遗传多态性，因此，利用SSR分子标记开展花生杂交种鉴定成为可能，已有研究也报道了SSR可有效鉴别花生杂种真伪(陈静等, 2009; 李双铃等, 2009; 张平湖和刘冠明, 2009)。

要快捷准确地进行杂种真伪鉴别，除了需要选择合适的DNA标记外，还必须建立一套快速的实验检测体系。以往的检测体系通常包含DNA提取和PCR分析两个环节，显得费时费力。如果能够简化及整合DNA提取过程，直接制备DNA模板进行PCR分析，鉴定过程将明显变得快捷。

本研究试图发展一套针对花生这类多糖多酚植物，无需进行DNA单独提取的SSR-PCR快速检测流程，用于鉴别花生杂交F1的真伪，在此基础上系统研究在人工规范操作下花生品种间杂交的成功率。

1结果与分析

1.1三种方法制备的DNA模版的SSR-PCR扩增比较

本研究用常规方法、Thomsom一步法以及改良Thomsom一步法制备DNA模版，并进行SSR-PCR分析，结果表明，三种方法均能扩增出清晰的PCR产物。与常规方法制备的DNA模板相比，后两者制备DNA模版扩增的产物条带较暗淡，但其亮度已能满足实验要求(图1)。采用Thomson方法也能扩增出产物，且条带亮度与改良方法相似，但由于缺乏抗氧化剂，该法制备的PCR模板只能在常温下保存数小时，在4℃下保存1d，随后严重褐化，最终无法扩增出产物。而改良方法制备的模板在4℃下最长可保存1个月(数据未列出)。

图1 三种方法制备的 DNA 模版的 PCR 扩增比较

1.2杂交F1种子田间真伪鉴定

粤油101和崖县小粒的形态表型差异明显，其正反交F1形态表型一致，且均与亲本存在较大差异，肉眼容易辨别真伪。经田间鉴定，在F1(粤油101×崖县小粒)中发现伪杂种53株，而在F1(崖县小粒×粤油101)中发现伪杂种62株。粤油223与汕油71的正反交F1形态表型与粤油223较接近，根据形态表型无法完全鉴别杂种真伪。通过仔细观察，最终分别从F1(粤油223×汕油71)和F1(汕油71×粤油223)中鉴别出伪杂种25和42株。由于粤油13和粤油20的形态表型高度相似，且其正反交后代也均与亲本高度相似，根据形态表型根本无法辨别杂种真伪，本研究最终放弃其杂交F1真伪的田间鉴定。

1.3 SSR-PCR鉴定真假杂种

利用40对SSR引物检测杂交亲本多态性，结果发现，共有5对引物(pPGSseq17E3, pPGSseq19E9, pPGPseq4G2, pPGPseq7G2和pPGPseq3A1)在粤油101和崖县小粒间检测出多态性，在粤油223和汕油71间检测出多态性的引物有3对(pPGSseq17E3, pPGPseq2G42和pPGPseq8H1)，而在粤油13和粤油20间检测出多态性的引物仅1对(pPGSseq18C5)。利用pPGSseq17E3检测F1(粤油223×汕油71, 汕油71×粤油223, 粤油13×粤油20, 粤油20×粤油13)群体单株，根据带型鉴别杂种真伪，同时出现父母本带型的为真杂种，只出现母本带型的为伪杂种(图2)。结果表明，粤油101与崖县小粒的正交F1有47株真杂种，反交F1真杂种比正交少，仅38株。粤油223与汕油71正反交组合F1真杂种率较接近，分别为56%和54%。粤油13与粤油20的正反交结果也较相似，真杂种率分别为53%和54%。比较田间和SSR-PCR鉴定结果发现，田间观察能够准确鉴别F1(粤油101×崖县小粒, 崖县小粒×粤油101)真伪，但F1(粤油223×汕油71)和F1(汕油71×粤油223)分别有19和4株被误判为真杂种。

图2 引物pPGSseq17E3在亲本粤油101和崖县小粒及其F1的扩增结果

1.4不同组合杂交成功率的差异

SSR-PCR检测结果表明，不同组合间杂交成功率存在一定差异(表1)。例如，组合(粤油223+汕油71)的平均杂交成功率与组合(粤油13+粤油20)相似，分别为55%和53.5%，而组合(粤油101+崖县小粒)的平均成功率仅42.5%，小于其他两个组合。另外，同一组合正反交成功率也不完全一致。如崖县小粒×粤油101的成功率仅38%，小于粤油101×崖县小粒(47%)。

表1 花生F1真假杂种的田间和 SSR 鉴定结果

2讨论

尽管田间形态表型观察仍是花生杂种真伪鉴别的主要方法，然而该方法存在不准确的缺点。本研究表明，针对形态表型差异明显的亲本，田间观察能准确鉴别其杂交F1真伪，但对于形态表型较相似的亲本则不然。由于SSR-PCR是从DNA水平上鉴定杂种真伪，具有高度可靠性。因此在作物杂交后代真伪和种子纯度鉴定中有广泛应用。本研究采用的“一步法”极大地简化DNA模板制备流程，从根本上实现SSR-PCR的快速检测，使分子标记鉴定杂种真伪在实际操作中具有可行性。

本研究中F1群体真杂种率较低(37%~56%)，与品种的开花特性存在一定关系。尽管理论上花生人工杂交成功率可达100%，但实际操作中常由于花器结构小，母本去雄不彻底，导致自交形成伪杂种(陈静等, 2009)。本研究中粤油101与崖县小粒的反交成功率低于正交，可能与崖县小粒花器小，去雄难度大有关。此外，不同组合间杂交成功率存在一定的差异，其中F1(粤油101×崖县小粒)的杂交成功率均低于其他四个组合，这可能与两个品种的其他特性有关，例如花期。崖县小粒的开花时间通常比粤油101迟一周以上。另外，根据多年的杂交经验，影响杂交成功率还包括杂交技术、天气条件。熟练的杂交技术是成功的关键、阴雨天气则会影响授粉的成功率。

3材料与方法

3.1材料

以6个花生品种(粤油101, 崖县小粒, 粤油223, 汕油71, 粤油20和粤油13)为亲本(品种由广东农科院作物所种子资源库提供)，于2010年春季通过人工杂交获得6个正反交组合的F1杂种，其中F1(粤油101×崖县小粒)种子134粒，F1(崖县小粒×粤油101)种子126粒；F1(粤油223×汕油71)种子150粒，F1(汕油71×粤油223)种子127粒；F1(粤油13×粤油20)种子165粒，F1(粤油20×粤油13)种子138粒。

3.2供试材料的田间种植与表型鉴定

2011年3月1日进行田间播种，杂交亲本和F1植株按5行区种植，行距25 cm，株距20 cm。播种时亩施钙镁磷肥25 kg，45%复合肥15 kg，喷施48%毒死蜱100 g水溶液30 kg，覆土、喷施乙草胺除草剂。4月4日追施45%复合肥25 kg，4月29日喷施0.2%磷酸二氢钾亩追施45%复合肥15 kg。由于花生整个生育阶段气候干旱，灌水3次。分别用10%吡虫啉、48%毒死蜱、阿维菌素100克配成500倍液喷施，防治蓟马、蛴螬、斜纹夜蛾，防治虫害4次。随机选取F1单株进行编号挂牌，每个组合选取100株。在成熟期观察F1单株形态表型进行真假杂种判断。

3.3 DNA模板制备

本研究采用三种方法制备DNA模板并进行比较。(1)常规方法，参照克拉克等(1998)的方法；(2)Thomson和Henry(1995)的“一步法”。(3)改良Thomson的方法。针对花生叶片的多糖多酚特性，引用Thomson和Henry (1995)的方法中的植物裂解液BufferA配方，增加β-巯基乙醇，使得配方变为：100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；l mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，0.1% β-巯基乙醇。剪取3 mm²花生嫩叶，置入1.5 mL离心管，加入100 μL改良后的BufferA，充分震荡，95℃水浴10 min，再次充分震荡，取1 μL上清作为DNA模板用于SSR-PCR扩增。

3.4 SSR检测

采用40对花生栽培种基因组SSR引物筛选亲本DNA多态性，引物序列来自Ferguson等(2004)。PCR扩增缓冲液为2×Power Taq PCR Master Mix (Bioteke, 北京, 中国)。PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 7 min。扩增产物采用6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电泳槽型号: DYCZ-30 (六一牌, 北京, 中国), 电泳缓冲液1×TBE, 电压150 V, 时间1 h)，0.1% AgNO₃染色，BIORAD凝胶成像系统观察(洪彦彬等, 2009)。

作者贡献

洪彦彬、李少雄、李杏瑜和朱方何是本研究的实验设计和实验研究的执行人；洪彦彬、李少雄完成数据分析，论文初稿的写作；李杏瑜和朱方何参与实验设计，试验结果分析；梁炫强是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(30900907, 30971819)、广东省自然科学基金项目(9151007010000001)和粤港关键领域重点突破项目(2008A0242000-09)共同资助。

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